史载,利玛窦逝世6年之后(1616年),在南京发生了一场大规模的教难,史称“南京教案”。当时南京天主教会在耶稣会传教士王丰肃(Alfonso Vagnoni)主持之下,教务蓬勃发展,信徒日渐增多,许多知识分子和社会名流都加入了教会。因应需要,他们建造了一座大教堂,称“圣十字教堂”,于1611年落成。据萧若瑟《中国天主教传行考》记载,该堂“顶上高悬白玉十字架,合城望见,中国前此未有也。”此后教会更加发展,信徒数目跃居全国首位。此现象引起南京礼部侍郎沈漼的仇视,于1616年,连向万历皇帝呈上两道奏疏,指控耶稣会传教士反对祭祖和破坏中国传统孝道;并诬告他们图谋不轨,将天主凌驾于天子之上,与“大明”相抗衡,实为朝廷隐患,故當除灭。遂掀起大规模的仇教、反教运动,下令抓捕王丰肃和谢务禄(Alvaro Semedo)等神父,对他们施以酷刑,然后把他们囚入木笼中,押解至广州,再递解去澳门。如此被驱逐的还有熊三拔(Sabbatino de Ursis)和庞迪我(Pang Diwo, Diego de Pantoja)等对朝廷大有贡献的科学家。当时虽有朝廷重臣、著名科学家徐光启等人为传教士们极力辩护,却收效甚微,悲剧还是发生了。酷刑、侮辱加上长途颠沛流离,使熊三拔和庞迪我抵澳门后不久便死去,年皆仅40多岁。
史载,康熙登基之时尚幼,由鳌拜等四大臣辅政。朝廷钦天监中国监官杨光先等人伺机向耶稣会传教士发难,参奏他们“历法荒谬,邪说惑众,潜谋造反。”结果,时任钦天监监正的耶稣会士汤若望(Johann Adam Schall von Bell)、监官南怀仁(Ferdinand Verbiest)等人皆遭逮捕并判以重刑。汤若望被判处凌迟,打入死牢。众臣议决之时,京师突发大地震,大臣们皆惊骇逃命。及回屋再议,又再次震荡不止。此后连震数日,造成无数房屋倒塌。期间宫内又燃起大火。众大臣视此为上苍发怒,才不得不上报孝庄皇太后。素来对传教士抱有好感的皇太后聞言大为震怒,遂责令他们放了汤若望等人。时年74岁、对明清两朝大有贡献的老科学家汤若望经此折腾,身体瘫痪,不能说话,获释后不久即含冤死去。数年后,成年后的康熙查明事实真相,亲自为汤若望等人平反,赐地赐银予汤若望以厚葬,并率群臣出席汤若望的葬礼,按中国习俗向他致敬。而那位始作俑者、以陷害他人而谋得钦天监监正的杨光先则被削职为民,赶出京师,遣返原籍。还乡路上,途经山东德州时,背部突生一恶疽,剧痛难忍,哀号而亡。